高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，高效液相色谱仪在医药、食品、饲料、化工、检测、教学、环境等众多分析领域的应用十分广泛，很多色谱工作者在操作高效液相色谱仪的过程中出现了各种各样的问题。以高效液相色谱仪为例，来分享一下高效液相色谱仪在操作过程中遇到的一些常见问题以及解决方法：
一、液相色谱仪液体漏出针管或放空管怎么办
如果样品漏出放空管，可能是放空管低于针管，导致虹吸；如果样品漏出针管，可能是放空管高于针管，导致虹吸。可以调整放空管，使其出口与针管处于同一水平面。
手柄处于进样位置时，虹吸现象会持续到放空管和针管排空为止。处于取样位置时，虹吸现象则会一直持续到放空管、针管和定量环全部都排空为止。若是使用低于进样针的长放空管，会产生很大的虹吸力，需要特别注意。
用长连接管的原因之一是为了防止来自管道末端的会导致缓冲盐结晶的蒸发作用。如果液相色谱仪以完全进样方式向定量环内大量进样，在注射器插入之前吸入的空气会被排出。但是若以部分进样方式进样，空气就不会被完全排出。在这种情况下，为了防止空气进入定量环，可以再仍处于进样位置时，即将切换向取样之前，插入含有下一种样品的注射器。
这样可以防止定量环被虹吸。当定量环由于虹吸而排空，定量环内充满空气，当手柄切换至进样时，空气的存在会引起系统压力降低。
二、液相色谱仪中色谱峰为什么分叉
1、色谱柱污染
液相色谱仪在开始时没问题，在使用一段时间后出现这个问题，可能是由于污染引起的。这时需要对色谱柱加强冲洗，即使用比方法流动相更强的溶剂冲洗色谱柱。
2、保护柱失效
如果样品基质比较脏，使用一段时间之后，发现的峰分叉或拖尾等问题，很有可能是保护柱失效造成的。一般粗略判断标准，塔板数、压力或分离度的改变超过10%，就需要更换保护柱了。
3、接头连接不正确
如果液相色谱仪色谱柱在使用过程中发现每个峰的峰形都出现问题，先考察是否有连接问题。
管线可能太长或太短——这种情况可能导致渗漏或峰分叉/拖尾。如果管线太长，密封圈位置不当，将发生渗漏。如果管线推出的距离不够，将会产生一段死空间，形成混合腔，导致柱外体积，使峰形变坏。
4、溶剂效应
在反相LC中， 如使用100%有机溶剂或100%强溶剂，大体积进样时，将使液相色谱仪色谱峰过早洗脱出色谱柱，导致峰变形。这时可以对分析物进行蒸发浓缩，从而减少进样体积。或者进样溶剂改为用水稀释，与流动相更为兼容，即使进样体积较大也不会出现峰变形。
较早流出的峰或靠近溶剂前沿的峰更容易出现拖尾。在液相色谱中用溶于流动相的小体积进样最为理想。
5、样品过载
当进样量超过柱子的容量，样品峰会呈现分叉或拖尾，解决方案就是减少进样量。这种问题一般在使用小体积色谱柱是表现更为明显，所以色谱柱方法从常规250mm或150mm长色谱柱转化到体积较小的快速分析柱时，进样量要按照柱体积的减小的比例而减小。
6、色谱柱塌陷
液相色谱仪由于柱塌陷引起的峰分叉，很难修复。如果流动相pH>7或在色谱柱pH耐受范围临界点附近长时间使用，是比较容易造成硅胶填料溶解塌陷。如果出现色谱柱塌陷，就会看到色谱图中的每个峰峰形都会发生变化(峰拖尾、加宽或分叉)，短时间内可以反方向运行，建议直接更换色谱柱。
7、柱前筛板部分堵塞
液相色谱仪长期分析脏样品，如果没有保护柱或在线柱前过滤器，颗粒物和强吸附物很可能在柱入口筛板发生堵塞，同时伴随着压力升高，解决办法一般是色谱柱反冲。1.8um粒径的色谱柱尽量避免反冲，最好在色谱柱前安装在线过滤器和保护柱。
8、色谱柱性能下降
色谱柱会受到其分析的各种目标物、使用各种流动相并分离不同的样品基质等的影响发生一些微妙的变化，从而引起峰分叉、拖尾或保留时间的改变。
在使用新色谱柱时保留其测试样品色谱图非常重要，在使用一段时间后进行比较，就能发现性能上的变化。如果分离度下降导致不能进行良好定量，这根色谱柱就应该丢弃并更换了。
三、液相色谱仪分析中柱钝化的原因
液相色谱仪分析中长时间连续地使用柱，填料的组分会发生变化。强滞留组分可能被永久性地“键合”于填料上，或者填料表面发生化学附着，键合相可能被部分地去掉，引起保留的变化。
1、污染物的吸附
填料表面积累性地吸附样品中强保留组分，使填料表面阻塞，所有组分保留减少，塔板数下降，可以看到柱头填料变色或稍有损失。可用两种处置方法：用保护柱；用强留东西冲洗去掉脏污。用反冲的方法更有效，让柱放空而不通过检测池。
2、键合相损失
在使用液相色谱仪柱过程中，键合相的有机层会慢慢损失。应避免使用极端的pH值。水和甲醇似间太多，而且也不一定能恢复到原来柱的性能。
3、柱过载和介质效应
柱过载，一般情况是峰拖尾，保留时间减小，高浓度样品更严重。减少进样量常客服。样品的组成有下列情况也可使柱过载，这就是介质效应。
四、液相色谱仪色谱柱失效的原因
1、筛板堵塞
色谱柱入口筛板堵塞是液相色谱仪最常见的问题之一，会导致柱压升高、色谱峰拖尾、塔板数降低等问题。通常分析样品中微粒杂质最有可能堵塞色谱柱入口，因此分析时，需要先过滤或者离心，乳浊或浑浊样品应以0.25µm滤膜处理，也可用针头过滤器过滤。进样器与泵密封垫的磨损也会带入微粒，在进样阀与色谱柱之间使用0.25µm或0.45µm的在线过滤器，通常可以避免这类问题。
2、强保留样品组分
强吸附性的样品组分吸附在柱头填料上，能严重地影响液相色谱仪色谱柱寿命。像生物组织或体液的提取物、天然产物等复杂样品，极易造成柱头的污染。相对较纯的样品，一般不会出现这一问题。色谱柱应用中，色谱峰严重拖尾或分裂往往是强保留污染物在柱头吸附的体现。
3、色谱柱装填不良
装填不良的色谱柱，在短时间应用后，填充床的压缩通常使柱头处产生塌陷，导致柱效突然降低。液相色谱仪色谱柱的初始评价指标，如塔板数、不对称因子等往往不能很好地表征色谱柱床层的稳定性，这种情绪只能在实际应用中发现。
4、压力因素
液相色谱仪色谱柱使用过程中的骤然压力波动、机械撞击或温度骤然变化都会对色谱柱床层产生影响，导致峰形变差和柱效降低。进样过程中，进样阀转动太慢可引起压力波动，使色谱柱床产生裂隙，在柱切换时也存在同样的问题。使用填充良好的色谱柱，在较低柱压下操作，可大大减少由压力波动造成的色谱柱损坏。
